ELISA常见问题
一、标准曲线拟合不良
1.移液错误，这可能导致添加到ELISA样品孔中的试剂浓度不正确。特别是在使用多通道移液器时，确保移液器按照制造商的标准进行准确校准和使用非常重要。
2.标准品原液降解。这可能是由于ELISA试剂盒储存不当所致；使用降解的标准品原液时，实际浓度比标示浓度低，产生的OD值可能会低于预期，假设依然按照其标示浓度来稀释，会导致标准曲线不准确。
二、高背景
1.由于洗涤不充分。洗涤对于去除残留在微孔板孔中的任何未结合物(即非特异性结合的抗体、蛋白质和检测试剂)至关重要。
在每个洗涤步骤结束时，将板倒置在无菌纸巾上。如果孔中残留了洗涤缓冲，在板倒置时轻轻敲击板的底部以完全排出每个孔。
2.使用浓度不足或未优化的封闭缓冲液。理想情况下，封闭缓冲液将与所有非特异性相互作用位点结合，而不会改变或干扰靶表位以进行抗体结合和进一步检测。如果结果显示背景较高，则可能需要通过增加浓度来优化封闭缓冲溶液，也可以添加少量吐温20。
3由于过长的孵育时间。过长的孵育时间会增加抗体交叉反应和特异性结合的可能性，造成高背景。
三、弱或者无信号
1.可能由于样本保存不当降解而引起。
2. Elisa中用到的试剂都需要恢复为室温条件下才能使用，使用过冷的试剂会阻碍与目标分析物的结合、也有可能是由于使用了错误或浓度不足的抗体，阻碍抗体与待检测物的特异性结合。
3.最后也可能因为移液器在加样时会划伤样品孔的壁，导致在壁上包被的抗原或抗体脱落，从而阻止抗原抗体结合并产生信号。
四、信号过高
1.样品或者阳性对照吸光度过高，可能因为没有经过充分稀释，需要在加样前稀释样品或者对照品浓度。如果是阴性对照出现信号过高现象，应该考虑交叉污染，必要时应该更换枪头。2.也可能是捕获抗体和检测抗体发生反应，或者是洗版不彻底，残留未结合物，抗体量过大也会导致非特异性结合增加。
五、高CV值
1.原因之一是由于孔内有气泡，气泡会导致样品浓度和吸光度不准确。
2.孔的清洗不彻底，未洗去未结合物或者液体有残留都会导致浓度不准确。
六、不显色
1.单祥本不显色可能因为样本蛋白浓度过低。
2.单标准品不显色可能因为保存不当降解或者稀释时未充分混匀。
3.如果两者都不显色可能由于孵育阶段抗原和抗体没有充分混匀接触，也有可能漏加了抗体。