β-Glucuronldase抑制剂筛选试剂盒（荧光法）
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β-Glucuronidase抑制剂筛选试剂盒
（荧光法 100rxn）
YM0022
一、产品概述：
β-Glucuronidase是一种功能强大的水解酶，可介导内源性固醇葡萄糖醛酸、酸性粘多糖、药物葡萄糖醛酸化产物的水解。特别在多种内外源性物质（例如：胆红素、胆汁酸、双氯芬酸、野黄芩苷、伊立替康等）的肝肠循环中发挥着决定性的作用。β-Glucuronidase除了主要分布在人体肝脏、小肠等组织中，在肠道菌中表达更为丰富。近年来研究表明，肠道菌中β-Glucuronidase活力的高低与临床药物伊立替康诱发迟发性腹泻等严重毒副反应具有直接关系。因此，β-Glucuronidase的抑制剂可有效缓解伊立替康等药物诱发的毒副作用，具有重要研究意义。本方法借助β-Glucuronidase的高特异性荧光底物，通过检测加入待测化合物前后水解反应速率的变化，测定待测化合物对β-Glucuronidase的抑制能力，求得IC50等抑制参数。
本检测方法具有背景干扰低、灵敏度高、适合高通量筛选等优势。
β-Glucuronidase（葡萄糖醛酸苷酶）抑制剂筛选试剂盒
二、产品组分：
组分 | YM0022 （100rxn） |
缓冲液 Reagent A | 25 mL |
检测底物Reagent B | 105 μL DMSO溶解成2 mM |
酶蛋白冻干粉Reagent C | 105 μL超纯水溶解40 U/mL，加缓冲液A稀释十倍至4 U/mL |
阳性抑制剂Reagent D | 10 μL DMSO溶解成10 mM |
三、保存条件：
组分 | ME105 （100rxn） |
缓冲液 Reagent A | 4 oC保存6个月 |
检测底物Reagent B | -20 oC保存3个月，分装保存 |
酶蛋白冻干粉Reagent C | -80 oC保存3个月，分装保存 反复冻融，易损失酶活 |
阳性抑制剂Reagent D | -20 oC保存3个月 |
四、自备材料：
1.5毫升离心管、涡旋混匀器、恒温混匀仪或水浴箱（气浴箱）、荧光检测黑板、多功能荧光酶标仪、离心机。
五、实验步骤：
实验开始前，将冰箱存放的试剂和酶蛋白溶液放置于冰板上融化，检测试剂用推荐的试剂溶解，然后进行下述操作。
1
样品准备：将2 mM底物（Reagent B）用缓冲液A（Reagent A）稀释10倍，待用。
孵育反应及检测：孵育反应液总体积为200 μL，推荐检测底物浓度10 µM，推荐β-Glucuronidase酶浓度为0.2 U/mL，使荧光强度对照样品/空白样品≥10，推荐其他反应条件为37 oC孵育15-60 min。
2
对照样品加入1 μL DMSO溶媒以抵消检测样品中有机溶剂对酶活性的抑制作用
对照样品 | 检测样品 | 阳性抑制样品 | 空白样品 | |
待测化合物(μL) | -- | 1 | -- | -- |
阳性抑制剂(Reagent D) (μL) | -- | -- | 1 | -- |
DMSO溶剂(μL) | 1 | -- | -- | 1 |
酶蛋白溶液(Reagent C) (μL) | 10 | 10 | 10 | -- |
缓冲液(Reagent A) (μL) | 179 | 179 | 179 | 189 |
涡旋轻度混匀，37 oC预热3 min | ||||
底物（稀释后的Reagent B）(μL) | 10 | 10 | 10 | 10 |
加入底物（Reagent B）轻度涡旋混匀，起始反应，并于37 oC孵育30 min；反应完成后加入100 μL冰乙腈强烈涡旋震荡；反应液于4 oC, 20000 g离心10 min；吸取上清液200 μL置于多孔黑板，于激发波长600 nm、发射波长660 nm条件下检测荧光 | ||||
3
剩余活性计算：（检测样品荧光值-空白样品荧光值）/（对照样品荧光值-空白样品荧光值） × 100%
六、附录
阳性抑制剂组样本剩余活性
七、注意事项：
检测试剂形态为薄膜状或者粉末状，附着在离心管内壁上，使用前请将离心管短暂离心使其聚集到底部。小心开启管盖，避免粉末飞扬造成损失。加入所需的DMSO，盖好管盖，涡旋震荡使其充分溶解。检测试剂配制完成后应避免反复冻融。
八、参考文献：
Highly Selective NIR Probe for Intestinal beta-Glucuronidase and High-Throughput Screening Inhibitors to Therapy Intestinal Damage. ACS Sens. 2018;3(9):1727-34.