TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（555 橙红荧光）50T

产品描述：

细胞凋亡的一个显著特点是细胞染色体DNA的降解，这是一个较普遍的现象。这种降解非常特异并有规律，所产生的不同长度的DNA片段约为180bp-200bp的整数倍，表现为琼脂糖凝胶电泳中呈现特异的梯状Ladder图谱，本试剂盒采用TUNEL法，应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(Terminal DeoxynucleotidylTransferase,TdT)在凋亡细胞断裂DNA的3´-OH末端催化掺入EZ555-dUTP。555-dUTP标记的DNA可以用荧光显微镜直接观察或者用流式细胞仪定量。TUNEL法可以选择性的检测凋亡细胞，而非坏死细胞或因辐照和药物治疗而造成的DNA链断裂的细胞。TUNEL实验中，TdT酶催化dUTP掺入断裂的DNA链的3´-OH末端。抗原标记的dUTP（如digoxin-dUTP、生物素-dUTP），因为它可以直接进行原位检测，是一种更快速、直接的检测手段。

订购信息：

产品组分：

运输与保存：

蓝冰运输。-20℃保存；组分B需避光保存于-20℃，避免反复冻融。有效期见外包装。

【注】：组分A、B中含有有毒、致癌成分Sodiumcacodylatetrihydrate和Cobaltouschloride，使用时请佩戴口罩、手套，接触皮肤后，请立即有大量水冲洗，废液请按有毒物质处理。

实验材料（自备）

PBS缓冲液（pH~7.4）

4%多聚甲醛（inPBS）

牛血清白蛋白(BSA)或正常的羊、牛血清

70%乙醇（自选）

脱蜡溶剂（石蜡切片样本）

操作步骤：
1.样本准备：

细胞样品
（1）可选：准备一份阴性对照样本（加入不含TdT酶的TUNEL反应液）。

（2）PBS清洗细胞2次。

（3）细胞固定：加入适量4%多聚甲醛(pH7.4)溶液，4℃放置30min。

（4）PBS清洗细胞2次。
（5）通透细胞：加入冰上预冷的70%乙醇，在-20℃孵育4h。细胞能在70%乙醇中-20℃的条件下保存1
周。或者细胞可用配制于PBS中的0.2%TritonX-100溶液通透，室温放置20min。
（6）PBS清洗细胞2次。

石蜡组织切片
（1）室温下用二甲苯浸泡石蜡组织切片2次，每次5min，以彻底脱掉石蜡。

【注】：二甲苯有毒，易挥发，请在通风橱中进行此操作。
（2）室温下，将切片样本浸没于无水乙醇中漂洗2次，每次5min。
（3）室温下，将切片样本连续浸没在不同浓度梯度的乙醇（95%、90%、80%、70%）中，每种浓度各漂洗 1次，每次5min。
（4）室温下，将切片浸没于纯水中漂洗1次，每次3min，再将切片浸没于1×PBS中漂洗1次，每次3min，用滤纸小心吸干切片样本周围多余液体。
（5）用免疫组化笔在切片样本周围描绘样品轮廓，以便下游通透与标记。
（6）按1:100的比例，将2mg/mL的ProteinaseK溶液用1×PBS稀释，使其终浓度为20µg/mL。每个样本上滴加100µL稀释好的ProteinaseK溶液，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育20min（Proteinase K的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。
【注】：蛋白酶K可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落，所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30min，4µm左右的片子可以用10min，但30µm左右的可用30min。过长易脱片、过短起不到通透效果。
（7）PBS浸润清洗切片2次，每次5min，用滤纸吸去多余的液体，将处理好的样品放在湿盒中保持湿润。【注】：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

冰冻组织切片
（1）将冰冻切片放置于室温的片架上，室温20min，晾干。

（2）将载玻片浸没在4%多聚甲醛溶液（inPBS）中，室温固定30min。
（3）PBS浸润清洗切片2次，每次5min。

（4）用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。
（5）按1:100的比例，将2mg/mL的ProteinaseK溶液用1×PBS稀释，使其终浓度为20µg/mL。每个样本上滴加100µL稀释好的ProteinaseK溶液，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育10min（ProteinaseK 的孵育时间、温度需根据不同类型组织样本进行优化）。
【注】：蛋白酶K可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落，所以要最优化孵育时间长短。时间一般为10~30min，4µm左右的片子可以用10min，但30µm左右的可用30min。过长易脱片、过短起不到通透效果。
阳性处理(仅阳性对照进行此步骤，其他样品直接进行TUNEL反应步骤)
（1）按1:10的比例用ddH2O将10×DNaseIBuffer稀释成1×DNaseIBuffer备用。

（2）滴加100µL1×DNaseIBuffer到已通透的样本上，室温平衡5min。
（3）用1×DNaseIBuffer以1:100稀释DNaseI(2U/μL)，使其为终浓度20U/mL的工作液。
（4）轻轻吸掉多余液体，加入100μL浓度为20U/mLDNaseI工作液，室温孵育10min。
（5）轻轻吸掉多余液体，PBS清洗样品2次。

2.TUNEL反应：

（1）每个样本加入100μLTUNEL平衡缓冲液，孵育5min。
（2）预先配制TUNEL反应混合液：每个样本需要已加入1μLTdT酶的50μLTUNEL反应缓冲液。

（3）弃去平衡缓冲液，用滤纸小心吸去切片样本周围的多余液体，每个样本加入50μLTUNEL反应混合液。

a.贴壁细胞，用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。37℃避光孵育60min。
b.悬浮细胞，可加入微孔板中，采用微孔板振荡器进行孵育或每隔15min温和的震荡反应管，使之充分反应。37℃避光孵育60min。
c.组织样本，用盖玻片使缓冲液均匀覆盖样本。将样本平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育2h，湿盒底部铺一张含少量水的纸巾保持湿度。37℃避光孵育2h。

（4）去掉反应液，在1×PBS的染色缸中浸泡润洗2次，每次5min。再使用适量配制于PBS中的0.1% TritonX-100，其中含5mg/mLBSA的缓冲液清洗样本3次，每次5min，以降低背景。
（5）（可选）复染：每个样本滴加浓度为2μg/mL的DAPI染液，避光室温孵育10min。染色完后，轻轻去掉染液，并将样本在1×PBS中浸泡润洗3次，每次5min。
（6）（可选）封片：将样本先纯水浸没5min，再放入70%乙醇浸没5min，再80%乙醇浸没5min，90%乙醇浸没5min，95%乙醇浸没5min，无水乙醇浸没5min，最后将切片样本置于染色缸中以新鲜的二甲苯浸泡透明化处理2次，每次5min（通风厨中操作）。脱水完成后，擦去切片周围的液体，每个切片样本滴加50μL抗荧光淬灭封片液，盖上盖玻片，用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片，去除气泡以使封片完全。
（7）用荧光显微镜或流式细胞仪观察、分析，EZ555与TexasRed染料的光谱类似，激发波长、发射波长分别为555nm，565nm（凋亡细胞应被标记上明亮的红色荧光，没有加入TdT酶的阴性对照样本未被标记上荧光）。

注意事项：

1.本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。
2.荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
3.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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