双荧光素酶报告基因检测试剂盒 (高通量型）
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双荧光素酶报告基因检测试剂盒使用说明
（高通量型）
产品型号：YM0002-1
产品规格：100T
产品说明：
报告基因检测常用于研究真核生物基因表达调控，萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶可以分别催化底物萤光素(luciferin)和腔肠素(coelenterazine)发出生物萤光(bioluminescence)，这种发光反应具有良好的光学特征和浓度线性范围，同时检测的灵敏度高，可达到10-20mol。两种催化反应最适浓度不同，因此互不干扰，配合使用形成一套高灵敏的双荧光素酶报告基因检测系统，其中海肾萤光素酶常作为内参照。
萤火虫萤光素酶是一种分子量约为61 kDa的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，催化luciferin氧化成 oxyluciferin，在此过程中会发出波长约为560 nm的生物萤光。海肾萤光素酶是一种分子量约为36 kDa的蛋白，在氧气存在的条件下，催化腔肠素(Coelenterazine)氧化成coelenteramide，在此过程中会发出波长约为480 nm的生物萤光。在后加入海肾萤光素酶底物时，可有效淬灭萤火虫荧光素酶催化luciferin 的发光，而不干扰海肾萤光素酶的活性，从而实现双萤光素酶报告基因检测。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer)或)或多功能酶标仪进行测定。通过萤光素酶与其底物催化发光的体系，可以高效、灵敏地检测基因的表达。检测原理如图所示：
图1.荧光素酶报告基因反应原理图
试剂盒组分：
名称 | 规格 | 保存条件 |
5x Universal lysis Buffer（ULB） | 20 mL | -20℃ |
Fluc Buffer A | 5 mL | -20℃ |
Fluc substrate | 干粉 | -20℃ |
Rluc Buffer B | 5 mL | -20℃ |
50x Rluc substrate | 100 μL | -20℃ |
保存运输条件：冰袋运输，-20℃保存6个月，-80℃保存更长时间。
操作步骤：
1. 试剂准备：
（1）1x Universal lysis Buffer（ULB）配置：取所需体积的5x Universal lysis Buffer临用前用三蒸水稀释至1x用；
（2）Fluc buffer A 工作液：试剂盒首次启用时，将Fluc buffer A全部加入到Fluc substrate中，适当吹打摇匀至粉末完全溶解后，分装到棕色管中-20℃保存备用；
（3）Rluc Buffer B工作液：临用前取50x Rluc substrate用Rluc Buffer B稀释至1x用（按需配置），配置好的Rluc Buffer B工作液在2-3 h内使用有效（试剂配置过程中注意避光）。
2. 细胞裂解:
（1）细胞裂解：取出孔板放置至恢复室温，加入适量体积1x ULB振荡器摇匀，室温裂解15min。
细胞裂解液推荐使用量：
细胞培养板型号 | 96孔板 | 24孔板 | 12孔板 | 6孔板 |
1x Universal lysis Buffer（ULB）/孔 | 30 μL | 60 μL | 80 μL | 120 μL |
（2）荧光酶标仪设定，正确开启仪器，点击检测，选择生物发光检测功能，根据本批样本的灵敏度选择合适增益与积分时间，默认为增益135，积分时间10 s。
3. 检测：
1) 移液枪吹打混匀裂解液后，吸取20 μL到黑色孔板底部。（样品数量过多时候建议使用移液枪经转移和后续加液操作，若使用四周不透光的培养板可省略转移操作）
2) 向每孔中加入100 μL Fluc buffer A，轻柔快速吹打混匀三次后，室温孵育反应5-10min后，上机检测记录发光值（F值）。
2) 向每孔中加入100 μL Rluc buffer B，轻柔快速吹打混匀三次后，室温孵育反应5-10min后，上机检测记录发光值（R值）。
（为保证结果准确性，在加入Fluc buffer A或Rluc buffer B后，请在1h内完成检测）
4. 数据分析：
（1）实验设计：根据实验目的，每组实验均应设置空白对照组，对照组和处理组。
a. 空白对照组
背景F：未转染细胞裂解液+ Fluc buffer A。
背景R：未转染细胞裂解液+ Fluc buffer A + Rluc buffer B。
注：空白对照组样品量须与实验样品量相同，且与实验样品含有相同的培养基/血清组合。
b. 对照组：转染细胞未经实验因素处理 (即对照组F和对照组R)。
c. 实验组：转染细胞经实验化合物处理 (即实验组F和实验组R)。
计算结果：对照组比值=(对照组F-背景F)/(对照组R-背景R)，实验组比值=(实验组F-背景F）/(实验组R-背景R)。
表达倍数= 实验组比值/对照组比值。
5. 注意事项:
（1）反应温度：酶促反应对温度较为敏感，加样检测前务必将检测试剂以及细胞培养液平衡至室温（20-25℃）。
（2）检测仪器：能检测化学发光的仪器都适用，但由于不同仪器的设置和灵敏度不同，测得的光信号值也会不同。 检测板：为防止孔间干扰，推荐使用不透光酶标板。
（3）发光信号会受到检测环境如培养基组分、温度等影响，应确保同组内不同样本检测条件一致。
（4）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套。
（5）本产品仅作科研用途！
图2.荧光素酶报告基因检测试剂盒操作示意图
5. 实验范例：
在96孔板中接种适量细胞过夜至贴壁状态，第二天进行如下转染：1.含有FXR基因启动子区的荧光素酶报告基因表达载体质粒；2.含有FXR基因启动子区转录因子E2功能的重组表达载体质粒；3.海参荧光素酶重组表达载体质粒。转染6h向每孔中加入不同单体药物培养48h，其中设置空白溶剂DMSO组。最后按试剂盒说明书操作裂解随后进行荧光素酶报告基因活性检测，结果如下（对应孔中所标白色字体数值为阳性激动剂的激动倍数）:
图3.59种单体药物对X基因启动子区荧光素酶报告基因激动倍数热图（A1:为空白溶剂对照组；A2-J6: 59种FDA上市药物的实验组）
经过上述实验的高通量筛选确定F3孔对应单体药物对FXR启动子区激动效果最强，激动倍数为45。同某进口“P”品牌一同测定该药物对FXR基因的激动曲线，并计算EC50，结果如下：
图4.红色：云贺生物品牌测定F3单体药物激动FXR基因启动子区荧光素酶报告基因响应曲线；黄色：进口“P”品牌测定F3单体药物激动FXR基因启动子区荧光素酶报告基因响应曲线（EC50）